如果您在使用 His 标签蛋白进行实验时，曾遇到过基线漂移、上样速度慢或动力学数据不稳定等问题，那么您并非个例。这些问题长期以来一直困扰着市面上几乎所有的 Anti-His 生物传感器。本文将深入揭秘 Gator Bio 与 AI 蛋白质设计公司 Monod Bio 合作开发 HIS XT 生物传感器的全过程。这款新一代 Anti-His 生物传感器以 AI 设计的 NovoBody™ 蛋白为核心，突破了传统技术的性能瓶颈。我们将从传统单克隆抗体作为识别元件所面临的固有限制讲起，介绍如何借助计算机蛋白质设计（in silico design）对其进行创新替代，并深入解析传统 Anti-His 探针为何难以满足生物膜干涉技术（BLI）对高质量检测的要求，以及我们如何通过蛋白质工程成功克服这些限制，实现了更快的上样速度、显著降低的基线漂移，以及对 N 端和 C 端 His 标签蛋白均保持稳定一致的检测性能。

幕后揭秘

为什么科研人员需要一款更优秀的 Anti-His 生物传感器？

看似简单的 His 标签（及其各种衍生形式），实际上是目前生命科学研究中应用最广泛的蛋白标签之一。然而，正如许多研究人员所体会到的，这种简单易用的标签在实际应用中也伴随着一些不可忽视的挑战。在本文中，我们将分享历时数年的研发历程，讲述 Gator Bio 如何打造一款性能更优的 Anti-His 生物传感器。从研发过程中遇到的核心技术难题，到与 AI 蛋白质设计专家合作，通过人工智能设计全新的蛋白识别元件，我们一步步突破了传统 Anti-His 生物传感器的性能瓶颈，最终打造出市场领先的新一代产品。无论您是否使用 Gator 的仪器，我们都希望本文分享的技术思路和研发经验，能够为所有从事 His 标签蛋白研究的科研人员提供有价值的参考和启发。

我们的传统 Anti-His 生物传感器已被全球数百家客户广泛使用。His 标签蛋白之所以成为科研中的“标配”，主要得益于几个优势：

1. 许多蛋白表达载体默认携带 His 标签；

2. His 标签体积小，通常不会影响蛋白质的天然结构或生物活性；

3. 此外，多家厂商提供的 His 标签纯化树脂也使蛋白纯化成本保持在较低水平。

正因如此，Anti-His 生物传感器成为 Gator Bio 最早推出的生物传感器之一。它能够帮助用户直接从未经纯化的细胞裂解液中捕获 His 标签蛋白，无需完成蛋白纯化即可进行定量分析或结合动力学分析。对于许多实验室而言，这种工作流程可以大幅节省实验时间，提高研究效率。后来，我们又推出了 Ni-NTA 生物传感器，其对 His 标签配体具有略高的结合亲和力。然而，即便如此，Anti-His 生物传感器凭借更广泛的适用性和成熟的使用体验，依然是用户更青睐的选择。

然而，客户反馈也持续暴露出一些共性问题：

1. 样品加载时间较长，通常需要 5 分钟甚至更久；

2. 基线漂移明显，影响结合动力学测量的准确性；

3. 配体固定信号较弱，导致对小分子分析物与皮摩尔（pM）级高亲和力相互作用的检测较为困难；

4. 不同 His 标签蛋白之间的检测性能差异较大，实验结果一致性不足。

这些问题并非 Gator Bio 独有，而是 BLI（生物膜干涉）技术厂家普遍面临的挑战。原因在于，市面上几乎所有厂商的 Anti-His 生物传感器都采用了相同的核心技术路线——单克隆抗体作为 His 标签识别元件。虽然 Gator 传统 Anti-His 生物传感器在基线稳定性方面已经优于市面上的其他同类产品，但我们始终认为，它仍有进一步提升的空间。

知识小课堂｜Anti-His 生物传感器与基线漂移

什么是基线漂移？为什么 Anti-His 生物传感器更容易受到影响？

传统 Anti-His 生物传感器采用单克隆抗体作为捕获分子，将 His 标签配体固定在生物传感器表面。然而，这类抗体与传感器表面的结合并不十分牢固，其相互作用强度相对较弱。在检测过程中，如果捕获分子逐渐从生物传感器表面解离，传感图（sensorgram）的基线便会持续向下偏移，这种现象称为基线漂移（baseline drift）。基线漂移会对结合动力学分析造成明显影响。虽然实验中通常会利用基线数据对分析物的结合信号进行扣除（baseline subtraction），但这种校正并不能做到完全准确。原因在于，分析物结合阶段实际上同时发生着多种动态过程，包括：

1. 分析物与配体的结合和解离；

2. 配体自身从生物传感器表面的解离；

3. 已结合分析物的配体以及未结合分析物的配体，均可能发生解离。

由于这些过程相互叠加，简单的基线扣除无法完全消除基线漂移带来的影响，往往会引入较大的动力学拟合误差，从而降低结合动力学参数分析的准确性。

对于高亲和力、解离速率较慢的蛋白质相互作用而言，这一问题尤为突出。当捕获抗体与 His 标签配体之间的解离速率快于待测的His 标签配体与分析物之间的解离速率时，实验中便无法准确区分检测信号究竟来源于His 标签配体从生物传感器表面的解离，还是来源于分析物与配体之间的解离。两种解离过程相互叠加，最终会对动力学分析造成干扰，降低数据质量，并影响结合动力学参数的准确测定。

图 1：Gator Anti-His 生物传感器与另一款市售 Anti-His 生物传感器对比。两款生物传感器均加载 His 标签 PD-L2 至约 0.5 nm 的加载信号，随后进行 1800 秒的解离监测。在这 1800 秒的基线阶段，Gator Anti-His 生物传感器的结合信号仅下降了 18%，而另一款市售 Anti-His 生物传感器的已结合蛋白信号则下降了 62%。

为什么传统 Anti-His 生物传感器难以可靠测定皮摩尔（pM）级相互作用？

Anti-His 生物传感器所采用的 Anti-His 抗体通常与 His 标签之间的结合亲和力较低，一般处于微摩尔（μM）至纳摩尔（nM）水平，因此其解离速率 (k_off) 较快。当测定皮摩尔（pM）级高亲和力蛋白质相互作用时，由于这类相互作用本身解离极为缓慢，即使捕获探针仅发生少量解离，也会产生明显的基线伪影（baseline artifacts），从而掩盖真实的结合信号，影响动力学分析结果的准确性。相比之下，若采用结合更牢固、解离速率更慢的捕获分子固定 His 标签蛋白，则能够显著降低基线漂移和伪影的影响，更有助于准确测定皮摩尔（pM）级相互作用的结合动力学参数。

打造真正的新一代 HIS XT 生物传感器

我们如何借助计算蛋白质设计，解决 His 标签捕获长期存在的技术挑战

什么样的捕获分子才是理想的 BLI 捕获分子？

几十年来，抗体一直是 BLI 生物传感器中最常用的捕获分子，因为它们制备相对简单、商业化程度高，并且能够满足许多常规应用的需求。然而，当我们从 BLI 检测技术本身的需求出发，重新审视理想捕获分子应具备的特性时，发现基于抗体的方案存在一些难以避免的固有局限，包括：

1. 结合亲和力较低；

2. 对不同 His 标签蛋白的检测性能一致性不足；

3. 存在亲合效应；

4. 传感器再生效果有限。

为了寻找更理想的解决方案，我们历时数年，对来自多家厂商的数十种 Anti-His 抗体进行了系统评估，希望找到一种既具有更优的基线稳定性，又具备更快结合速率的抗体。然而，研究结果表明，大多数针对传统免疫分析优化的 Anti-His 抗体，并不具备高性能 BLI 检测所需的关键特性，因此难以满足高精度动力学分析的要求。

为什么 Anti-His 单克隆抗体的结合能力普遍较弱？

造成 Anti-His 单克隆抗体结合能力普遍不足的原因，主要有以下三个方面：

1. Anti-His 抗体的设计目标与 BLI 生物传感器的需求并不一致。

大多数 Anti-His 单克隆抗体生产商的产品主要面向 Western Blot、免疫检测等传统应用，其研发重点通常是提高抗体的洗脱性能或稳定性，达到满足实验需求即可，而并非针对非标记检测技术进行优化。相比之下，Gator BLI 生物传感器更关注缓慢的解离速率，以确保捕获的 His 标签蛋白能够在整个检测过程中保持稳定，从而获得更准确的动力学数据。

2. His 标签属于重复序列，这给抗体识别带来了天然限制。

His 标签由多个连续的组氨酸残基组成，属于一种重复序列。因此，抗体首次接触 His 标签时，很容易出现非最佳结合位点的结合方式，从而形成较弱的结合。此外，许多 Anti-His 抗体对 C 端 His 标签具有明显偏好，因为这种构型更容易形成稳定的结合。但这种偏好也意味着，当 His 标签位于 N 端或受到空间位阻影响时，抗体的识别能力可能明显下降，限制了其适用范围。

3. His 标签本身并不是理想的免疫原，难以获得高质量抗体。

His 标签具有免疫原性较低的特点，因此开发高亲和力的 Anti-His 抗体本身就具有较大挑战。主要原因包括：

l  His 标签序列较短，可供抗体识别的表位有限；

l  组氨酸残基的电荷状态会随周围环境变化，影响抗体识别的一致性；

l  当 His 标签与目标蛋白融合后，可能被蛋白结构遮挡，进一步增加抗体识别难度。

为什么 Anti-His 抗体对不同蛋白和不同 His 标签位置的结合亲和力差异很大？

凡是购买过抗体产品的科研人员都会发现，抗体厂商很少公布抗体的动力学参数，例如结合速率（k_on）、解离速率（k_off）或平衡解离常数（K_D）。对于识别固定蛋白表位的普通抗体而言，这些参数通常相对容易测定且具有较好的一致性；然而，对于 Anti-His 抗体来说，要在各种不同的 His 标签蛋白之间保持稳定一致的结合性能，却是一项极具挑战性的任务。

为了系统评估这一问题，我们选取了来自 5 家不同厂商的 20 种 His 标签蛋白，分别利用 Gator 传统 Anti-His 生物传感器和新一代 HIS XT 生物传感器测定其 K_D 和 k_off（采用单点估算方法）。实验结果显示，不同蛋白之间的结合性能差异十分明显。造成这种差异的主要原因包括：

1. His 标签所处的局部电化学环境不同；

2. 部分蛋白在 His 标签与目标蛋白之间引入了连接肽（linker，例如 G4S），改变了标签的空间可及性；

3. His 标签可能位于蛋白的 N 端或 C 端，不同位置会影响其暴露程度和结合构象。

由于 His 标签本身序列非常短、变化极少，因此其周围的结构和化学环境对抗体识别能力具有决定性影响。

图 2 展示了上述 20 种 His 标签蛋白对应的 K_D 和 k_off 测试结果。可以看到，采用 Gator Bio 传统 Anti-His 生物传感器时，不同蛋白之间的 K_D 和 k_off 存在较大的波动；而使用 HIS XT 生物传感器后，这种差异得到显著改善。

图 2： 20 种不同 His 标签蛋白与 Gator Anti-His 和 HIS XT 生物传感器的 k_off 和 K_D 估算结果。实验采用单点测定，并通过曲线拟合生成结果。图中 Anti-His 生物传感器仅显示了 19 个结果，因为其中有 1 种蛋白未发生结合。可以看出，HIS XT 生物传感器在整体结合性能和相互作用持续时间方面均表现出更一致的提升，同时出现结合性能较差的情况明显更少。

什么是亲合效应？为什么使用单克隆抗体作为捕获配体会产生这一问题？

在 BLI 中，亲合效应通常是指生物传感器表面的两个蛋白同时与溶液中的一个蛋白发生相互作用。当生物传感器表面使用双价捕获分子时，两个捕获位点彼此距离很近，这意味着被捕获的配体之间可能足够接近，从而同时与同一个分析物结合，或者由于附近始终存在另一个结合位点，阻止分析物解离。

这类伪象在 BLI 实验中非常常见，会使配体-分析物相互作用看起来比实际的 1:1 亲和力更强，从而影响动力学测定的准确性。通过使用小型单结构域结合蛋白作为捕获分子，我们可以减少这一问题。

什么是再生？为什么再生性能对生物传感器开发至关重要？

再生效率是指生物传感器在短时间暴露于低 pH 条件下，仍能够成功去除已结合 His 标签蛋白的能力。这一性能无论从实验操作还是经济成本的角度来看都至关重要。能够将同一支生物传感器重复用于多个结合循环，不仅可以降低单次实验成本，还能保证实验的一致性。再生性能较差意味着要么需要在实验过程中更换生物传感器，要么接受配体去除不完全的结果（表现为加载量不一致，以及由于已结合配体未被完全去除而导致分析物结合结果不一致）。对于高通量应用而言，能够使用同一支生物传感器完成整个板（通常为 12 列）的检测，可显著简化实验流程。

即使在将候选范围缩小到少数几个具有高性能和高一致性的候选分子之后，再生效率仍然是最终筛选过程中最重要的评价指标之一。与前述动力学实验类似，我们希望确保最终用于 HIS XT 的候选分子能够在各种不同配体条件下都保持稳定、可靠的性能。图3展示了最终候选分子在这一测试过程中的部分实验结果。

图 3： HIS XT 生物传感器在四种不同 His 标签蛋白上的再生效率。左上： His-HSA，右上： PD1-His 作为配体，Anti-PD1 作为分析物，左下： MD1-His 作为配体，PD-L2 作为分析物，右下： Human Thrombopoietin Receptor-His 作为配体，Human Thrombopoietin 作为分析物

计算机设计方法

经过多年筛选来自不同供应商的抗体后，我们得出了一个结论：市场上已经没有更好的 Anti-His 抗体可供选择。Gator 的传统 Anti-His 生物传感器已经是市售产品中的最佳之一，但仍然存在抗体作为捕获分子所固有的局限性。

真正的突破来自一种完全不同的方法。我们与专注于计算蛋白质设计的 Monod Bio 展开合作。其基于 AI 的设计方法已经获得了概念验证结果，表明他们有能力设计出性能更优的 Anti-His 结合蛋白。

AI 设计如何加速生物传感器开发？

与依赖生物进化过程（例如通过免疫动物制备抗体）或组合文库筛选方法（例如噬菌体展示）不同，想要为 Anti-His 结合产生真正全新的解决方案，唯一途径是采用 in silico（计算机模拟）方法。利用 AI 进行蛋白质设计，是从目标结合特性出发，反向设计能够实现这些特性的蛋白质序列。

针对 His 标签捕获，我们要求 Monod Bio 对以下特性进行明确优化：

1. 对 N 端和 C 端 His 标签中的多聚 His 基序具有强结合能力；

2. 采用单结构域架构，以避免亲合效应；

3. 在再生条件下保持稳定性。

这种方法绕过了数月的筛选过程，并为结合动力学中的结合速率和解离速率提供了更高的一致性。

什么是 Monod Bio 的 NovoBody™ 蛋白？

不同于继续采用市场上已有的传统抗体和纳米抗体支架，Monod Bio 选择了新的方向，开发了 NovoBody™ 蛋白——一种通过从头计算设计产生的结合蛋白。与来源于动物免疫获得的抗体，或来源于骆驼科动物的 VHH 结构域不同，NovoBody™ 蛋白是利用 AI 算法从零开始设计的蛋白质。它们可以针对特定需求进行优化。在本案例中，NovoBody™ 蛋白被设计用于实现对 His 标签的一致性结合，单结构域结构及再生稳定性。 由于 NovoBody™ 蛋白采用单结构域设计，因此可以避免双价抗体固有的亲合效应问题。

在一年时间内，随着 Monod Bio 不断优化其设计方案，以及我们持续优化偶联化学方法，Monod Bio 向我们提供了多个候选分子。其中许多候选分子表现出了可接受的动力学性能，但部分候选分子在与生物传感器表面的偶联过程中存在困难，另一些候选分子的再生性能不够稳定。最终，只有一个候选分子表现出了明显更优的性能。

作为验证流程的一部分，我们测试了 27 种不同的 His 标签蛋白，这些蛋白涵盖了不同的分子量、标签位置（N 端和 C 端）、电荷特性以及不同生产厂商。这一蛋白测试面板使我们能够评估 HIS XT 的广谱特异性。实验数据证实，与传统基于抗体的探针相比，HIS XT 在结合活性、稳定性和一致性方面均实现了显著提升。下方的图 4展示了测试结果，以及 HIS XT 与传统 Anti-His 和其他市售 Anti-His 生物传感器之间的性能对比。

图 4： 在一个样本实验中，对 20 种不同 His 标签蛋白进行测试所得的加载信号变化和信号损失情况。这些蛋白涵盖不同的分子大小、标签位置以及不同生产厂商。

为什么称为 HIS XT？XT 对 Gator Bio 生物传感器意味着什么？

虽然捕获分子是影响性能的关键因素，但生物传感器的性能同样取决于表面化学和光学设计。生物传感器开发不仅需要固定捕获分子，还需要优化其表面化学性质，并调整生物传感器的光学特性。

其中一项关键创新，是利用我们专有的XT 光学涂层制备生物传感器。该涂层能够显著提高传感器表面每个分子产生的总信号。在 HIS XT 上产生 1 nm 偏移信号所需的表面分子数量，远低于传统 Anti-His 生物传感器在产生相同信号偏移时所需的分子数量。这意味着，即使面对更小的分析物，也无需通过过量加载生物传感器来提高灵敏度，仍然可以获得可用的数据。同时，这也意味着可以在传感器表面加载更少的蛋白质，并保持良好的信号，从而进一步降低发生亲合效应的风险。

正如前文图 4 所示，在标准化的 2 分钟实验中，使用相同的配体加载孔时，HIS XT 生物传感器产生的总信号超过其他市售 Anti-His 抗体生物传感器的 4 倍。这一优势来源于两方面：一是改进后的 k_on 结合速率，二是总信号放大的效果。

实现最佳性能的技术注意事项

与任何高性能捕获系统一样，使用过程中都需要注意实验方案优化。对于经验丰富的用户而言，这些注意事项并不陌生，但在优化实验方案时仍需牢记以下几点。

1. 注意避免过度加载生物传感器

由于 HIS XT 生物传感器对 His 标签蛋白具有非常高效的结合能力，使用传统实验方案时很容易造成过度加载。对于动力学实验，我们建议使用浓度 10 nM 或更低的蛋白。由于每个分子产生的信号更高，因此无需使用大量蛋白即可获得优异的信噪比。

2. 管理第二基线解离

尽管 Anti-His NovoBody™ 具有非常长的结合半衰期，但部分配体会在第二基线开始阶段发生少量解离（图 5）。在加载过程中减少蛋白使用量并避免达到饱和状态，有助于降低这一影响。建议在加载后加入 60–120 秒的基线步骤，使这一初始解离过程达到平台状态。不过，通过适当的参考扣除这一步骤可能并非必需。

3. 优化再生条件

我们针对 HIS XT 生物传感器所使用的捕获分子进行了再生效率筛选，可以明确地说，在使用我们的 Regen Buffer pH 2.0（No Salt）（货号：20-5207）时，通常可以期待 HIS XT 生物传感器实现 10 次以上再生循环。然而，His 标签化学性质可能存在差异，部分蛋白可能需要在低 pH 缓冲液清洗之外，进一步优化再生条件。

我们不建议使用含有高盐的低 pH 缓冲液进行再生，因为这可能会降低生物传感器的性能。

图 5： 加载 His 标签 PD-L2 的 HIS XT 生物传感器，随后进行 1800 秒的解离监测。在这 1800 秒的基线阶段，仅观察到 9% 的已结合蛋白信号损失，其中大部分损失发生在开始后的 60–120 秒内。

常见问题

Ni-NTA 和 Anti-His 捕获方式在 BLI 中有什么区别？

Ni-NTA 依赖于金属螯合化学机制，其中镍离子通过配位作用与组氨酸残基结合。这种方式能够提供较强的结合能力，但容易受到样品中螯合剂、二价阳离子以及 pH 变化的影响。Anti-His 生物传感器（包括 HIS XT）则利用蛋白-蛋白相互作用进行捕获，通常对不同样品条件具有更好的耐受性，并且在不同实验条件下能够提供更加一致的性能。Ni-NTA 通常表现出略高的亲和力，但其非特异性结合倾向也更高，因此对于复杂样品基质而言并不是理想选择。

如何选择 N 端 His 标签或 C 端 His 标签？

HIS XT 的设计目标之一就是消除这一偏差——它能够以相同的效率捕获 N 端和 C 端 His 标签，使研究人员可以灵活选择标签位置，而不会影响捕获性能。

因此，His 标签位置的选择完全取决于蛋白质折叠情况、表达因素，以及目标末端是否具有可及性。添加G4S 连接肽可以有所帮助。

HIS XT 生物传感器能否检测低于 100 pM 的相互作用？

可以。改进后的基线稳定性（漂移降低 58%）使得对超高亲和力相互作用进行可靠测量成为可能。

与传统 Anti-His 探针相比，哪些应用最能受益于 HIS XT 生物传感器？

涉及以下应用的实验能够从 HIS XT 中获得最显著的提升：

1. 高亲和力相互作用（皮摩尔至低纳摩尔范围）；

2. 小分子分析物（<15 kDa）检测；

3. 高通量表位分组（更快的加载速度）；

4. His 标签蛋白定量分析。

改进后的基线稳定性对于长时间动力学测量尤其具有价值，而更高的单位分子信号强度使得一些使用传统探针时低于噪声水平的相互作用也能够被检测到。任何需要进行多次再生循环的实验流程，也都能够受益于 HIS XT 稳健的再生性能。

结论

经过多年的优化与开发，我们很高兴推出 HIS XT 生物传感器。我们相信，HIS XT 代表了 His 标签捕获技术的一项重要进步，解决了该领域多年来一直存在的诸多根本性限制。

您在自己的研究工作中是否也遇到过类似的 His 标签蛋白捕获挑战？我们期待了解您的应用案例，并进一步了解科研社区正在面临的其他捕获分子相关挑战。欢迎通过电子邮件 info@gatorbio.cn 与我们分享您的想法。