Gator Plus+ 支持在 10°C–40°C 的温度范围内运行 BLI 实验。下面介绍这一温控范围所带来的全新应用可能性。

保持低温

生物膜干涉技术（BLI）因其快速、操作简便和高灵敏度而广受欢迎。传统 BLI 实验通常在 25°C 至 37°C 的温度范围内进行。Gator Plus+ 支持 10°C 至 40°C 的温控范围，覆盖范围超过以往任何一款 BLI 仪器。这一更宽的温控范围，使许多过去无法开展的实验成为可能，例如：使用稳定性较低的试剂进行检测； 测定快速结合/快速解离相互作用的动力学参数； 通过改变实验温度，研究分子相互作用的热力学性质和作用机制。

1. 使用稳定性较低的试剂

并非所有结合分子在室温下都能保持稳定。许多治疗和诊断相关分子（如 RNA、肽、纳米抗体和脂质纳米颗粒）在 25–37°C 下进行数小时实验时稳定性较差。当这些分子发生降解或聚集时，往往会导致异常或不一致的实验结果，而这些不一致性可能使数十甚至数百个候选分子的实验结果失去可信度。

然而，不仅是药物候选分子存在稳定性问题，许多潜在药物靶点也因稳定性不足而一直难以开展研究。例如，采用纳米盘捕获或使用去污剂溶解的受体，如 κ 阿片受体（KOR），以及 G 蛋白偶联受体（GPCR），包括 β₂ 肾上腺素能受体（β₂AR）、大麻素受体 CB2 和 腺苷 A₂A 受体，均已有研究表明，它们在室温下数分钟内就会失去结合活性。Gator Plus+ 支持在 10°C 下进行大规模实验，有助于提高这些分子的稳定性，并延长实验可进行的时间。

将实验温度降低至 10°C 还有助于减少长时间实验中的蒸发。蒸发通常会导致试剂浓度升高，从而影响实验稳定性。下面是一个示例：将 10 µg/mL 的生物素化 Protein A（ProA）加入含 BSA 的 K Buffer 中，并固定到 SA XT 生物传感器上，在 10°C 条件下连续实验 16 小时。实验过程中，每隔数小时将生物传感器转移到 96 孔板中的新缓冲液孔中，整个过程中未观察到因 BSA 聚集而导致的明显偏差。相比之下，在 25°C 条件下，大约 8 小时后便观察到基线上漂（图未显示）。原因是什么？在 25°C 条件下，16 小时实验结束时已有超过 50% 的液体蒸发，导致孔内 BSA 浓度增加约一倍，这可能是对照曲线出现基线上漂的原因。而在 10°C 下，实验过程中未检测到可测量的体积损失，基线上漂也几乎可以忽略。

图 1： 生物素化 ProA 固定到 SA XT 生物传感器上的传感图。在 10°C 条件下，生物传感器可在 Q Buffer 中连续放置 16 小时以上，实验过程中未出现任何问题，也未观察到可测量的液体体积变

2. 解析快速结合/快速解离相互作用

许多生物分子相互作用在进化过程中形成了弱结合特性，表现为结合速率快、解离速率快。

在之前的一篇Blog中，我们曾介绍过，将实验温度降低至 25°C 以下有助于更准确地测定 Fcγ 受体的结合动力学。采用这种方法，可以更清晰地捕获结合阶段和解离阶段开始时的陡峭曲线变化。这一方法同样特别适用于小分子、肽类以及其他微摩尔（μM）级亲和力的相互作用研究。

其原理在于，分子扩散和反应速率遵循阿伦尼乌斯动力学。降低温度会以可预测的方式同时减缓结合和解离过程。例如，在检测 Fcγ 受体亲和力时，每个候选抗体分子的 Fc 区都会与同一种 Fcγ 受体进行检测。此类实验的目的，是判断抗体工程改造是否导致 Fc 区发生变化。因此，只要所有候选样品和参比样品均在相同的实验条件下（例如 20°C）进行测定，那么由于实验温度不同而引起的 K_D 差异即可忽略，不会影响样品之间的比较。

3. 表征相互作用热力学及结合机制

基于表面的生物传感器技术（如 SPR）已被用于抗体-抗原相互作用的热力学分析数十年^[1,2]，但这种方法在 BLI 中应用相对较少。然而，借助 Gator Plus+ 更宽的温控范围（10°C–40°C，而非传统的 25°C–40°C），可以更加容易地区分焓驱动和熵驱动的相互作用。在多个温度下测定结合动力学和亲和力后，可以利用范特霍夫方程（Van't Hoff equation）计算结合过程中焓变（ΔH）和熵变（ΔS）的贡献。具体方法是：X 轴-1000/T（绝对温度 Kelvin 的倒数），Y 轴-平衡解离常数的自然对数 ln(K_D) 。根据范特霍夫方程，所得直线的斜率与焓变（ΔH）成正比，而Y 轴截距则与熵变（ΔS）相关。

公式 1： 范特霍夫方程，用于根据实验测得的动力学参数，计算分子相互作用过程中焓变（ΔH）和熵变（ΔS）的变化。

下面是一个实际案例：抗 HER2 抗体（曲妥珠单抗）与 HER2 的结合。我们在 10°C–40°C 的多个温度条件下，对这对结合分子的相互作用进行了测定，其传感图如下所示。

图2： 抗 HER2 抗体（配体）与 HER2（分析物）在 10°C–40°C 条件下的结合传感图。各测试温度下对应的 K_D 值列于表中。

这些结果与已发表文献报道一致^[3]。以这些实验室内部获得的数据为例，我们可以将各温度下测得的 K_D 值按照范特霍夫（Van't Hoff）作图方式进行绘制，从而得到下图，用于进行热力学分析。

图3： Anti-HER2/HER2 相互作用的范特霍夫图。可以看到，该相互作用整体上符合线性的 Van't Hoff 关系；而 10°C 条件下获得的数据点则偏离了这一线性关系，这与两步结合模型（two-step encounter/docking model）一致（后文将进一步解释）。

从范特霍夫图可以看出，该相互作用的斜率为负值，说明这是一个放热反应，即结合过程中会释放热量。因此，随着温度升高，其结合亲和力会降低。经过曲线拟合后，可以计算得到：

• 焓变（ΔH） = −34.0 kJ/mol（将拟合得到的斜率乘以气体常数 R）

• 熵变（ΔS） = +47.0 J/mol·K

这些结果是否合理？我们可以利用 25°C 条件下的吉布斯自由能方程（进行反推，验证根据拟合得到的热力学参数是否与 BLI 仪器实际测得的结果一致。

25°C 条件下实验测得的 K_D 为 3.74 nM，与根据范特霍夫图计算得到的 3.84 nM 非常一致。

需要说明的是，趋势线仅采用了 15°C 及以上的数据进行拟合，因为 10°C 的数据点明显偏离了线性关系。这种偏离本身具有重要的机制学意义。根据 Guardiola 等人提出的方法^[4]，可以利用艾林方程（Eyring equation）分别计算结合过程（k_on）和解离过程（k_off）的活化焓（ΔH‡）和活化熵（ΔS‡）。具体而言，将 ln(k_on/T) 和 ln(k_off/T) 分别对 1000/T 作图，每条直线的斜率即可得到对应步骤（结合或解离）的活化焓 ΔH‡，而两者之间的差值应与整体结合过程的焓变（ΔH）一致。

图4： Anti-HER2/HER2 相互作用的 k_off 和 k_on 艾林图（可使用顶部箭头切换查看）。利用这些图中直线的斜率和截距代入艾林方程进行计算，可以发现，10°C 条件下 k_off 数据点明显偏离线性拟合曲线，这表明在低温条件下，其解离机制发生了变化。

值得注意的是，10°C 条件下的数据点仅在 k_off 上偏离了线性艾林关系，而 k_on 并未出现这种偏离。这意味着，在这一低温条件下，复合物的解离速度远低于预期，而结合过程则几乎不受影响。对同一组数据进行阿伦尼乌斯分析，在采用更少理论假设的情况下，也得到了相同的活化焓结果^[1]。两种分析方法均得出一致结论：10°C 条件下存在异常的结合行为。

这些结果可由 SPR 的研究结果解释^[5]。研究认为，抗体结合过程包括两个连续步骤：首先是扩散限制的初始接触，随后发生构象重排，形成最终稳定的复合物。虽然 SPR 和 BLI 都将这两个步骤检测为一个整体的结合事件，但这两个过程对温度的敏感性存在明显差异。在本研究中，10°C 条件下，最终形成的稳定复合物表现出显著增强的稳定性。这说明结合过程中存在非零热容变化（ΔCp），与抗体-抗原界面疏水表面积被埋藏的现象一致。当温度由 10°C 升高至 15°C 时，这种额外的稳定作用逐渐减弱，相互作用重新表现出预期的线性温度依赖关系。

并非所有抗体都具有相同的规律。抗体亲和力会随温度升高而增强还是减弱，取决于结合过程主要受焓还是熵驱动，而这又反映了抗体-抗原结合界面的结构特征。例如，与 Anti-HER2 随温度升高亲和力下降不同，一些抗体已被证明在发热温度下具有更高的结合亲和力，这表明其结合过程主要受熵驱动^[6]。

这些因素在多特异性抗体设计中尤为重要。当一个抗体需要依次结合两个不同靶点时，第一个结合事件所消耗的热力学能量将限制第二个结合事件所能利用的热力学资源。具体来说，如果抗体在结合第一个靶点时发生了较大的构象变化，那么它可能缺乏足够的热力学能力进一步调整其余结构，以结合第二个靶点。因此，对每个结合臂分别进行温度依赖性的动力学分析，可以发现这类潜在的不兼容性，并帮助筛选热力学特性彼此兼容的结合臂组合。

Gator Plus+：10°C–40°C，采用 Peltier 温控技术

Gator Plus+ 是首款支持最低 10°C 精确控温的 BLI 仪器，可在 10°C–40°C 的整个温度范围内实现精准温度调节。该功能为标准配置，适用于 8 通道仪器，并兼容 96 孔板和 384 孔板。

低温实验的主要特点包括：

1. 采用Peltier温控系统，实现精确的温度控制，并在各个温度下保持稳定的基线；

2. 可在任意设定温度下完成完整的结合动力学和亲和力测定；

3. 兼容 Gator Bio 高性能生物传感器，如 HIS XT 和 Strep-Tactin 生物传感器，可进行再生后重复使用，并可用于不同温度条件下的实验。

快速开始

低温 BLI 是一种用途广泛的实验技术，但与其他技术一样，合理的实验设计能够获得更好的结果。

1. 缓冲液的渗透压和黏度会随温度变化。 因此，必须在每个实验温度下分别设置对应的缓冲液空白作为参考。不能使用 10°C 的空白曲线去校正 40°C 的样品数据。同样，也不能在不同温度的微孔板之间切换，而期望获得一致的基线。

2. 如果需要测试多个温度点，建议从低温开始。这样不仅能够更好地保证样品的稳定性和实验性能，而且由于热量向上传递，微孔板升温速度通常快于降温速度。

3. 为生物传感器水化和微孔板温度平衡预留足够时间。 在 10°C 条件下，通常约 10 分钟的平衡时间即可使样品板达到目标温度，然后开始采集数据。

4. 关注 K_D 的明显变化。 以上 Anti-HER2/HER2 的实验结果表明，对于典型的抗体-抗原相互作用，温度变化几摄氏度通常不会导致 K_D 出现显著变化。如果温度变化导致动力学参数发生剧烈改变，则原因可能并非亲和力下降，而是样品稳定性发生变化，例如高温下分析物聚集，或低温下非特异性结合（NSB）增加。

我们的应用团队已经在 GPCR 靶点、Fc 受体分析以及双特异性抗体等多个项目中开展了相关实验。如果您研究的靶点在室温条件下难以获得理想结果，欢迎联系我们，与我们的应用专家进一步交流。

参考文献

[1] D. J. Winzor and C. M. Jackson, “Interpretation of the temperature dependence of rate constants in biosensor studies,” Anal. Biochem., vol. 337, no. 2, pp. 289-293, 2005. Link to article

[2] H. Roos, R. Karlsson, H. Nilshans and A. Persson, “Thermodynamic analysis of protein interactions with biosensor technology,” J Mol Recognit., vol. 11, no. 1-6, pp. 204-210, 1998. Link to article

[3] V. L. Cruz, V. Souza-Egipsy, M. Gion, J. Pérez-Garcia, J. Cortes, J. Ramos and J. F. Vega, “Binding Affinity of Trastuzumab and Pertuzumab Monoclonal Antibodies to Extracellular HER2 Domain,” Int J Mol Sci., vol. 24, no. 15, 2023. Link to article

[4] S. Guardiola, M. Varese, M. Taulés, M. Díaz-Lobo, J. García and E. Giralt, “Probing the Kinetic and Thermodynamic Fingerprints of Anti-EGF Nanobodies by Surface Plasmon Resonance,” Pharmaceuticals (Basel), vol. 13, no. 6, 2020. Link to article

[5] C. A. Lipschultz, A. Yee, S. Mohan, Y. Li and S. J. Smith-Gill, “Temperature differentially affects encounter and docking thermodynamics of antibody-antigen association,” Journal of Molecular Recognition, vol. 15, pp. 44-52, 2002. Link to article

[6] R. C. Stan, K. S. Francoso, R. P. X. Alves, L. C. S. Ferreira, I. S. Soares and M. M. de Camargo, “Febrile temperatures increase in vitro antibody affinity for malarial and dengue antigens,” PLOS Neglected Tropical Diseases, vol. 13, no. 4, 2019. Link to article