深入理解蛋白质之间的相互作用是生物药开发的基础。生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）能够对这些原本不可见的分子结合过程进行实时、精准的可视化监测，从而揭示生物分子间的相互作用。

什么是 BLI？

生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）是一种基于光学原理的非标记检测技术，可实时监测传感器表面发生的分子结合过程。通过实时捕获结合事件，BLI 不仅能够测定生物分子相互作用的结合与解离速率，还能够评估其结合程度，因此被广泛应用于生物药发现与开发过程中的动力学分析和亲和力表征。

BLI 通过分析白光穿过专用生物传感器后产生的干涉图样来实现检测。其技术原理如下：

仪器将白光经光纤传导至玻璃生物传感器。传感器表面经过功能化修饰，固定有能够捕获目标蛋白的配体分子。当传感器浸入样品溶液时，目标蛋白与这些捕获分子发生结合。随着结合蛋白不断积累，传感器表面的生物分子层厚度逐渐增加。仪器通过检测参考层与蛋白层外表面两个反射界面之间的光学干涉变化，实时监测这一厚度变化。

光谱仪实时监测反射信号。基线校准后，系统持续追踪蛋白层厚度变化所引起的干涉图谱在全可见光谱区的偏移。仪器将这一变化实时绘制为传感图（结合曲线），横轴代表时间，纵轴以纳米位移（nm shift）量化干涉图谱的变化量。

Gator Bio BLI 平台

Gator BLI 仪器兼容标准 96 孔及 384 孔微孔板，单次运行可同时检测多达 32 个样品。基于微孔板的设计使仪器能够将生物传感器按顺序从一个孔移动至下一个孔，完整记录实验流程中每个步骤的结合数据。高通量性能让您每日轻松筛选数百个样品，同时确保动力学数据的精准可靠，助力科学决策。

了解 Gator BLI 仪器

BLI 如何测量结合

BLI 通过两种主要方式将结合响应转化为定量数据：一是测定结合动力学参数，二是测定总结合响应值。

定量分析流程

在浓度测定中，BLI 技术追踪分子结合的初始速率（nm/s），该速率直接取决于结合速率常数（k_on）与分析物浓度。二者之间的正比关系形成了浓度依赖性信号——分析物浓度越高，初始结合曲线的斜率就越陡峭。

快速定量，简单高效。 只需运行一系列已知浓度的标准品，即可生成校准曲线，再将未知样品与之比对，轻松得出定量结果。由于检测基于初始结合速率，整个分析过程极为快速，每个样品通常仅需不到2分钟，大幅提升实验效率。

基于初始速率分析的快速定量，每个样品检测仅需不到2分钟，结果立等可得。

动力学工作流程

动力学表征，精准解析分子相互作用。 BLI 技术可实时测定生物分子对之间的结合（结合）与解离（解离）过程。通过曲线拟合，可获得三项关键参数：

k_on （结合速率常数） —— 分子结合的快慢

k_off（解离速率常数） —— 分子解离的快慢

K_D（平衡解离常数） —— 整体结合亲和力

对于快速达到平衡的相互作用，可采用终点结合检测方式测定 K_D 值。BLI技术凭借极短的实验准备时间和多通道检测模式，在高通量筛选中优势尤为突出，助您轻松评估数十乃至数百个候选分子。

实时动力学追踪结合全流程——从初始结合到完全解离，完整呈现分子相互作用图谱

BLI 关键术语

为了帮助您更好地理解和查阅BLI相关文献，以下是一些关键术语的释义：

捕获分子 (Capture Molecule)：包被在探针表面的试剂，专门用于捕获结合对中的第一个分子。

配体 (Ligand)：被捕获到生物传感器表面的结合对中的第一个分子。

分析物 (Analyte)：结合到固定化配体上的第二个分子（即您研究的目标分子）。

基线 (Baseline)：仅含缓冲液的步骤，用于建立传感器的稳定起始信号，帮助您区分有效结合信号与仪器漂移。第二次基线也可用于验证配体与生物传感器的结合情况。

上样 (Loading)：动力学检测步骤，生物传感器接触含配体的溶液，使配体固定于传感器表面。

结合 (Association)：动力学检测步骤，含分析物的溶液与已固定配体的生物传感器接触，使结合发生。

解离 (Dissociation)：动力学检测步骤，生物传感器返回仅含缓冲液的环境，使已结合的分析物从传感器上释放。

实验设计注意事项

成功的 BLI 实验离不开精心的实验设计。以下是几个最关键的考量因素：

缓冲液匹配至关重要

BLI 是一种光学检测技术，其信号响应基于折射率的变化。如果实验步骤之间缓冲液成分存在差异，可能产生信号假象，干扰真实的结合数据。为确保最佳检测性能，请注意以下几点：

保持所有实验步骤中缓冲液条件的一致性

留意 pH 变化、DMSO、甘油、蔗糖及其他溶剂引起的折射率偏移

注意甘油不具有挥发性，可能残留在冻干蛋白中

进行定量检测时，先将生物传感器在与样品相似的缓冲液中预浸泡，以降低非特异性信号

选择合适的固定化策略

动力学检测需要将配体固定于生物传感器上，同时确保分析物的结合位点不被遮蔽。最常用的策略是靶向保守结构域或蛋白标签。

常见的捕获方式如下：

Fc 结合型生物传感器：Protein A、Anti-Mouse Fc XT、Anti-Human Fc —— 适用于抗体捕获

标签结合型生物传感器：Anti-His、Ni-NTA —— 适用于His标签蛋白；Strep-Tactin XT —— 适用于twin-Strep标签蛋白

生物素-链霉亲和素：不可逆结合，使用链霉亲和素生物传感器捕获生物素化蛋白（注：请选择适度生物素化方案，控制每个分子的生物素数量——赖氨酸常位于结合结构域，过度生物素化可能显著降低分析物的结合活性）

Fc 结合型与标签结合型生物传感器的一大优势在于可再生：通过简单的低pH洗涤即可去除已结合的分析物，实现生物传感器的重复使用，从而有效降低实验成本。

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优化分析物浓度范围

精准的动力学测量离不开合理的浓度选择。建议您的浓度梯度设置如下：

上限浓度：最高浓度应使结合曲线出现明显饱和趋势（开始进入平台期）

下限浓度：最低浓度应远低于半数结合饱和度

梯度分布：采用倍比稀释（通常为2倍或3倍），覆盖2~3个数量级的浓度范围

浓度过高

浓度过低

最佳浓度

利用Gator软件内置的模拟功能，对 K_D 值为1 nM的1:1结合模型进行模拟。模拟中设定1 nm响应值代表结合位点达到100%饱和。图中展示了多组浓度梯度，每组均采用2倍倍比稀释。其中，“过高”组起始浓度为1000 nM，“过低”组起始浓度为2 nM，而“最佳”组起始浓度为 50 nM。

尽量降低配体负载量

一个常见的实验误区是过度加载配体至生物传感器上。配体并非越多越好——过高的配体密度可能导致：亲合力效应，使数据分析复杂化；再生效率下降，影响传感器重复使用。

建议以能够获得清晰分析物结合信号的最小配体加载量为原则。对于大多数基于抗体的检测，通常将加载信号控制在 0.5–1.0 nm 范围内即可。

BLI 在分析工具体系中的定位

从 ELISA 升级到 BLI

许多实验室将检测方法从ELISA升级为BLI，因为实时结合监测能够提供完整的动力学信息，这是终点法检测无法比拟的。您得到的不是单一时间点的数据，而是结合与解离的完整动态过程。这使得问题排查更加直观——如果实验出现异常，传感图会清晰告诉您问题出在哪个环节，是结合不良、解离过快、非特异性相互作用，还是缓冲液效应。

BLI 较 ELISA 的核心优势：-实时获取动力学信息，而非单一终点结合数据-无需洗涤步骤-免标记检测-直接观测结合特异性-实验开发速度提升 10 至 100 倍

与 SPR 工作流程互补

许多使用 SPR 的实验室也常采用 BLI 进行快速候选分子筛选与优先级排序。SPR 擅长对少数高优先级候选分子进行精细化表征，而 BLI 凭借多通道检测的优势，能够让您高效评估数百个候选分子，并从中快速锁定前 10-20 个进行深入研究。

为什么实验室在 SPR 之外还要配备 BLI：

每天可筛选数百个样品（即使是基础型号仪器）

有更丰富的现货生物传感器，适用于多种项目类型

兼容标准微孔板，自动化整合更简便

更快的实验设置缩短了从样品到数据的时间

常规筛选的单样品成本更低

质量控制与生物工艺应用

BLI 在工业生产制造领域已成为不可或缺的技术，主要应用于：

快速定量：实时滴度测定，为工艺流程决策提供数据支持

活性检测：满足法规要求的活性测量

克隆筛选：细胞株开发过程中的高通量筛选

制剂稳定性：快速评估蛋白聚集和降解情况

在质控环境中，BLI 凭借其速度和重现性，成为常规批放行检测和过程监控的理想选择。

探索 BLI 在生产制造中的应用

快速对比：Gator BLI vs 其他结合分析技术

BLI：生物分析实验室的核心平台

经过多年的应用验证，BLI凭借其出色的速度与广泛的适用性，已成为生物分析实验室中值得信赖的主力平台。无论是新药发现、工艺优化，还是产品质量控制，BLI都能为您提供坚实的分析数据基础，助力科学决策。